ELISA檢測(cè)試劑盒：一文讀懂其原理與應(yīng)用

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)檢測(cè)方法，用于定量或定性檢測(cè)生物樣品中各種靶標(biāo)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、抗體、激素、肽類等。

  ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定) 是一種用于檢測(cè)液體樣品中靶向蛋白質(zhì)的固相酶免疫測(cè)定 (EIA) 技術(shù)。在 ELISA 中，首先將靶向蛋白質(zhì)（抗原）固定在固相載體表面，例如微孔板。然后，加入含有待測(cè)抗體的樣品，并與固定的抗原進(jìn)行結(jié)合。未結(jié)合的抗體會(huì)被洗滌去除。隨后，加入酶標(biāo)二抗，該二抗能夠特異性識(shí)別結(jié)合在抗原上的抗體。最后，加入底物溶液，底物會(huì)在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色深淺與樣品中靶向蛋白質(zhì)的濃度成正比，通過(guò)檢測(cè)顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向蛋白質(zhì)的含量。

  ELISA試劑盒自從60-70年代問(wèn)世以來(lái)，得到全世界科研工作者的認(rèn)可及推崇，在歐美及中國(guó)獲得很大的推廣，尤其是國(guó)內(nèi)生化領(lǐng)域的長(zhǎng)足發(fā)展。

  ELISA生物實(shí)驗(yàn)敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。ELISA一直被用作植物病理學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的重要工具之一。它是許多行業(yè)對(duì)其生物產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢查的首選檢測(cè)方法。在96孔板中進(jìn)行，可以在一次實(shí)驗(yàn)中測(cè)量和研究多個(gè)樣品。它與其他抗體測(cè)定不同，因?yàn)樗臄?shù)據(jù)再現(xiàn)性和定量結(jié)果。

  本文討論了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的工作原理、其類型、優(yōu)點(diǎn)和局限性及其在生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)中的應(yīng)用。

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定原理

  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)的工作原理基于抗原抗體之間的特異性結(jié)合。抗體是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，用于識(shí)別和結(jié)合特定的抗原，而抗原則可以是來(lái)自任何外來(lái)來(lái)源的分子，例如蛋白質(zhì)、多肽、病毒等。

  在ELISA實(shí)驗(yàn)中，通常使用特殊的固相載體，例如聚苯乙烯微孔板，其表面可以吸附抗原或抗體。大多數(shù)情況下，抗原會(huì)被固定在微孔板表面，然后加入含有待測(cè)抗體的樣品。如果樣品中存在與抗原特異性結(jié)合的抗體，則會(huì)與固定的抗原結(jié)合。未結(jié)合的抗體會(huì)被洗滌去除。隨后，加入酶標(biāo)二抗，該二抗能夠特異性識(shí)別結(jié)合在抗原上的抗體。最后，加入底物溶液，底物會(huì)在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過(guò)檢測(cè)顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

圖1 elisa檢測(cè)原理

  ELISA試劑盒類型

  ELISA分為常見4種類型，分別是直接ELISA法、間接ELISA法、夾心ELISA法和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。

  直接ELISA法

  直接ELISA法是一種簡(jiǎn)單快速的ELISA方法，其原理是將抗原或蛋白質(zhì)直接固定在固相載體表面，例如微孔板。然后，加入酶標(biāo)抗體溶液，該抗體能夠特異性識(shí)別和結(jié)合固定的抗原。未結(jié)合的抗體會(huì)被洗滌去除。隨后，加入底物溶液，底物會(huì)在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過(guò)檢測(cè)顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

  雖然直接ELISA法操作簡(jiǎn)單，但由于其只使用一種抗體，因此特異性可能較低，容易產(chǎn)生較高的背景信號(hào)，即更高的顯色或光密度讀數(shù)，這可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 直接ELISA法

  間接ELISA法

  間接ELISA法的步驟與直接ELISA法相似，但增加了一個(gè)使用酶標(biāo)二抗進(jìn)行檢測(cè)的步驟，從而提高了檢測(cè)的靈敏度。在間接ELISA法中，首先將抗原或蛋白質(zhì)固定在微孔板的孔中。然后，加入含有待測(cè)抗體（一抗）的樣品，并與固定的抗原進(jìn)行結(jié)合。未結(jié)合的一抗會(huì)被洗滌去除。

  隨后，加入酶標(biāo)二抗，該二抗能夠特異性識(shí)別并結(jié)合一抗。加入底物溶液后，底物會(huì)在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。顏色深淺與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過(guò)檢測(cè)顏色的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

  相比于直接ELISA法，間接ELISA法具有更高的靈敏度和更廣泛的應(yīng)用范圍，因?yàn)榭梢允褂枚喾N不同的二抗進(jìn)行檢測(cè)。

圖2 間接LEISA法

  夾心ELISA法

  夾心ELISA法是實(shí)驗(yàn)室中最常用的ELISA類型之一，其靈敏度和特異性都較高。在夾心ELISA法中，首先將捕獲抗體固定在微孔板的孔中。然后，加入含有待測(cè)抗原的樣品，并與捕獲抗體進(jìn)行結(jié)合。未結(jié)合的抗原會(huì)被洗滌去除。

  隨后，加入檢測(cè)抗體，該抗體能夠識(shí)別抗原上的不同表位，并與之結(jié)合。檢測(cè)抗體通常帶有酶標(biāo)或熒光標(biāo)記。最后，加入底物溶液，底物會(huì)在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)或熒光反應(yīng)。信號(hào)強(qiáng)度與樣品中靶向抗原的濃度成正比，通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的變化即可定量或定性分析樣品中靶向抗原的含量。

  夾心ELISA法的優(yōu)勢(shì)在于其使用了兩種抗體來(lái)識(shí)別抗原，從而提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，降低了背景信號(hào)的干擾。

圖3 夾心ELISA法

  競(jìng)爭(zhēng)法ELISA

  競(jìng)爭(zhēng)ELISA法主要用于檢測(cè)小分子抗原，其原理與其他ELISA方法有所不同。在競(jìng)爭(zhēng)ELISA法中，首先將抗原或抗原類似物固定在微孔板的孔中。然后，將待測(cè)樣品與酶標(biāo)抗原或抗原類似物混合，并加入到微孔板中。樣品中的抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)性地與固定的抗原或抗原類似物結(jié)合。

  未結(jié)合的抗原和抗體會(huì)被洗滌去除。隨后，加入底物溶液，底物會(huì)在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。如果樣品中靶向抗原的濃度較高，則會(huì)與更多的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致酶標(biāo)抗原的結(jié)合量減少，顯色反應(yīng)較弱，信號(hào)強(qiáng)度較低。相反，如果樣品中靶向抗原的濃度較低，則酶標(biāo)抗原的結(jié)合量會(huì)增加，顯色反應(yīng)較強(qiáng)，信號(hào)強(qiáng)度較高。

  通過(guò)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較，可以定量分析樣品中靶向抗原的含量。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的優(yōu)勢(shì)在于可以檢測(cè)小分子抗原，并且不需要制備針對(duì)小分子抗原的抗體。

  ELISA試劑盒檢測(cè)步驟

  以下是進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)的一般步驟。但需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整：

  準(zhǔn)備工作

  準(zhǔn)備包被緩沖液、封閉緩沖液、洗滌緩沖液、抗體溶液、底物溶液和終止液。

  將試劑盒從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫。

  打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)。

  包被

  向微孔板的孔中加入100μL肽溶液(4μg/mL，用包被緩沖液稀釋)。

  將板在37℃下孵育2小時(shí)或在4℃下孵育過(guò)夜。

  封閉

  除去包被溶液，并用100μL洗滌緩沖液(PBS-0.05%Tween20)洗滌3次。

  用紙巾擦干板子。

  向每個(gè)孔中添加100μL封閉緩沖液(3%脫脂牛奶的PBS溶液)。

  將板在37℃下孵育1小時(shí)。

  加樣

  用洗滌緩沖液洗滌板子3次。

  向每個(gè)孔中添加50μL稀釋的一抗溶液(稀釋比例根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定)。

  將板在37℃下輕輕搖動(dòng)孵育1小時(shí)。

  洗滌

  重復(fù)洗滌步驟3次，每次使用100μL洗滌緩沖液。

  顯色

  向每個(gè)孔中添加50μL稀釋的酶標(biāo)二抗溶液(稀釋比例根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定)。

  將板在37℃下孵育1小時(shí)。

  用洗滌緩沖液洗滌板子6次。

  將TMB底物溶液、乙酸和0.03%H2O2按照1:4:5的比例混合，制備顯色底物溶液。

  向每個(gè)孔中加入50μL顯色底物溶液。

  將板在37℃避光孵育15-30分鐘。

  終止反應(yīng)

  顯色足夠后，向每個(gè)孔中添加100μL終止液。

  讀數(shù)

  使用酶標(biāo)儀在指定的波長(zhǎng)下讀取每個(gè)孔的吸光度值。

  ELISA檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)和局限性

  優(yōu)點(diǎn)：

  操作簡(jiǎn)便：ELISA實(shí)驗(yàn)方案簡(jiǎn)單易行，只需進(jìn)行基本的實(shí)驗(yàn)操作，即可完成檢測(cè)。

  高通量：現(xiàn)如今ELISA可以使用96孔板或384孔板進(jìn)行檢測(cè)，能夠同時(shí)處理大量樣品，提高檢測(cè)效率。

  靈敏度和特異性高：ELISA利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)到樣品中微量的靶標(biāo)物質(zhì)，并具有較高的特異性，能夠區(qū)分目標(biāo)物質(zhì)和其它相似物質(zhì)。

  適用樣品類型廣泛：ELISA可以檢測(cè)各種類型的樣品，例如血清、血漿、細(xì)胞和組織提取物、尿液、唾液等。

  定量分析：ELISA可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析樣品中靶標(biāo)物質(zhì)的濃度，提供更精確的檢測(cè)結(jié)果。

  結(jié)果快速：ELISA實(shí)驗(yàn)通常可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，能夠快速獲得檢測(cè)結(jié)果。

  成本效益高：ELISA試劑盒價(jià)格相對(duì)便宜，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴的設(shè)備，因此具有較高的成本效益。

  局限性：

  結(jié)果易受影響：ELISA結(jié)果容易受到多種因素的影響，例如操作誤差、試劑質(zhì)量、樣品處理等，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  半定量檢測(cè)：雖然ELISA可以進(jìn)行定量分析，但其準(zhǔn)確性不如一些其他定量方法，例如質(zhì)譜法。

  信息有限：ELISA只能檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的存在和含量，無(wú)法提供有關(guān)靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等信息。

  交叉反應(yīng)：某些情況下，抗體可能與樣品中的其他物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

  背景信號(hào)：ELISA實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)出現(xiàn)背景信號(hào)，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)男Ｕ?/span>

  Elisa試劑盒應(yīng)用

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）作為一種靈敏、特異且用途廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)方法，在生命科學(xué)、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用。以下列舉一些重要的應(yīng)用領(lǐng)域：

  抗體和抗原檢測(cè)：ELISA可以用于檢測(cè)各種生物樣品中的抗體和抗原，例如血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。這使得ELISA成為研究免疫反應(yīng)、疾病診斷和疫苗開發(fā)的重要工具。

  傳染病診斷：ELISA是許多傳染病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)方法，例如HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。它可以檢測(cè)患者血清中的病毒抗原或抗體，幫助醫(yī)生進(jìn)行早期診斷和治療。

  疾病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究：在疾病爆發(fā)期間，例如最近的COVID-19大流行，ELISA快速檢測(cè)試劑盒被廣泛用于評(píng)估疾病的傳播范圍和趨勢(shì)，為公共衛(wèi)生決策提供重要數(shù)據(jù)。

  食物過(guò)敏原檢測(cè)：ELISA可用于檢測(cè)食品中的過(guò)敏原，例如花生、牛奶、雞蛋、堅(jiān)果等，幫助食品生產(chǎn)商確保食品安全，并為過(guò)敏人群提供指導(dǎo)。

  自身免疫性疾病診斷：ELISA可用于檢測(cè)自身免疫性疾病相關(guān)的自身抗體，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，幫助醫(yī)生進(jìn)行疾病診斷和監(jiān)測(cè)。

  藥物研發(fā)：ELISA在藥物研發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，例如用于藥物篩選、藥代動(dòng)力學(xué)研究、毒理學(xué)研究等。

圖4 通蔚生物試劑盒

  最后，相信大家通過(guò)上文對(duì)ELISA試劑盒原理有所了解。通蔚提供多種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且有效的ELISA試劑盒，主要采用夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，覆蓋3000個(gè)靶標(biāo)，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個(gè)種類。